本发明涉及基因敲入技术领域，特别是公开了一种基因敲入选育斑马鱼vmhc‑EGFP品系的方法。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术，首先，在斑马鱼基因vmhc终止密码子下游附近设计合适的打靶位点，利用体外合成特异性gRNA和Cas9蛋白按一定比例共注射斑马鱼1细胞期胚胎内，通过PCR测序分析该靶点有效性；根据斑马鱼vmhc基因的终止密码子上下游序列分别通过PCR扩增左右两个同源臂并分连接入质粒pMCS1‑2A‑EGFP‑MCS2（本实验室保存）克隆位点，即合成重组质粒pvmhc‑Left‑2A‑EGFP‑Right；利用该重组质粒，与gRNA和Cas9蛋白按一定比例注射进斑马鱼1细胞期胚胎内，待胚胎发育60h后，在荧光显微镜下观察胚胎心室组织中是否有绿色荧光蛋白特异表达，从而确定2A‑EGFP序列成功敲入vmhc基因的下游特定位点，并进一步通过PCR和Sanger测序鉴定。通过该构建的斑马鱼vmhc‑EGFP敲入品系可以在活体斑马鱼示踪vmhc基因的时空表达模式和表达水平，也可以直接观察分析斑马鱼心室形态结构变化。本发明实现了能有效且精确地在生物体基因组基因中的特定位点敲入外源基因；同时，利用该敲入品系可以作为心血管相关疾病研究以及药物筛选的一个理想实验模型。